Quando il Museo di Storia Naturale di Manhattan viene chiuso per restauri, tutti i pezzi vengono spostati allo Smithsonian Institute di Washington, che ospita una della maggiori collezioni del mondo. L’ex guardia notturna, Larry Daley (Ben Stiller) è diventato un imprenditore, ma non ha dimenticato i suoi vecchi amici, come Teddy Roosevelt il cowboy Jed (Owen Wilson), il legionario Octavius (Steve Coogan). La bizzarra compagnia, però, dovrà affrontare la minaccia del perfido faraone Kahmunrah (Hank Azaria). In loro soccorso, tuttavia, arriverà proprio Larry, che si occuperà di rimettere ordine nel nuovo museo animato, senza che nessuno se ne accorga. Tra i personaggi della storia che prenderanno vita durante l’avventurosa nottata: l’aviatrice Amelia Earhart (Amy Adams), Napoleone (Alain Chabat), il generale Custer (Bill Hader), Al Capone (Jon Bernthal) e Attila, re degli Unni (Patrick Gallagher).